微流控芯片在骨科疾病中的應用及前景

隨著老齡化社會的到來，與骨相關的疾病，例如骨質疏松癥已經成為人類的主要健康問題，并且由癌癥骨轉移引起的溶骨性病變的預后一直很差。研究人員已經研究了這些骨科疾病的發病機理，從而獲得了有效的治療方法。微流體芯片技術是近年來開發的流行技術。這項技術可以建立一個仿生的實驗平臺，在體內微環境體外，這已經受到越來越多的研究人員的青睞。在這篇綜述中，我們將以骨質疏松癥和癌癥骨轉移為例來說明發病機理，介紹微流體模型與骨科相關疾病研究的最新進展，并描述當前的方法及其局限性。

介紹

骨科作為現代臨床醫學的重要分支，主要研究骨骼肌系統的生理學和病理學，并借助藥物、外科手術或其他物理手段維持該系統的正常功能和形態。隨著社會的進步和時代的變遷，骨科的傷害譜也發生了巨大變化。例如普遍地減少了諸如脊髓灰質炎、骨髓炎、骨骼和結核病之類的疾病，但是交通事故造成的創傷大大增加了。人口老齡化還導致了老年性骨質疏松癥，類風濕性關節炎和骨腫瘤的相應增加。這種變化表明，骨科研究的重點也必須適應骨科的未來發展。骨科的未來發展不僅應加強與基礎醫學的融合，而且應將其他學科的研究成果轉化為可用的技術。例如，人工關節的進一步改進離不開材料科學和技術的發展。及時有效地將其他學科的新技術成果應用于臨床骨科，可以大大改善骨科疾病的診斷和治療。

近年來，微流控芯片技術逐漸普及，在生物醫學研究等領域顯示出廣闊的應用前景。細胞是生命活動的基本單位。近年來，細胞研究已從細胞水平發展到分子水平，形態學研究確定了亞微觀結構和分子結構，以進一步了解生命活動和發展的規律。微流控芯片技術的出現被認為是細胞研究的新的重要技術平臺。微流控芯片也稱為“芯片實驗室”，是一種將生物，化學和其他實驗集成在幾平方厘米的芯片上的新型科學技術，該芯片可以集成樣品制備、反應、分離并檢測為一體。

細胞研究中使用的微流控芯片技術具有以下優點：1）芯片尺寸小，通常可以控制在10–100μm的范圍內，而哺乳動物細胞的直徑大約為10–20μm，適用于它的成長；2）芯片的通道環境相對封閉，可以構建多維網絡結構，可以形成接近生理狀態的細胞空間特征；3）微觀通道環境增加了傳熱，傳質和氣體交換的速率；4）可用于高通量細胞分析，可同時采集多種生物信號；5）芯片上的多個單元可以靈活組合，并且可以進行集成的細胞研究。因此，細胞注射，培養，篩選，裂解，分離和檢測可以集成在同一芯片上。除了可控制的芯片結構外，還有許多芯片材料可供選擇。聚二甲基硅氧烷（PDMS）是一種高分子量有機硅化合物，是制備微流控芯片中使用最廣泛的材料之一。

將生物醫學臨床研究與微流控芯片技術相結合可以將這項技術帶入一個新的領域，也可以在生物醫學研究中取得一些突破。本文以整形外科中最常見的情況，骨質疏松和癌細胞轉移為例，并列舉了微流控芯片技術發揮的重要作用。

骨質疏松微流模型的建立與應用

骨質疏松癥是目前臨床上最常見的骨科代謝疾病之一。這是由于每單位體積的骨量減少和骨微結構破壞的多種原因引起的。臨床特征主要是骨痛，骨脆性增加和容易骨折。骨質疏松癥可分為三類：原發性，繼發性和特發性。原發性骨質疏松癥約占90％，分為I型（絕經后骨質疏松癥，PMOP）和II型（老年性骨質疏松癥，SOP）。繼發性骨質疏松癥是由諸如糖尿病，甲狀腺功能低下，白血病和惡性腫瘤等疾病或使用諸如糖皮質激素，肝素和免疫抑制劑等藥物引起的。特發性骨質疏松癥在8-14歲的青少年中更為常見。

在過去的20年中，人們還通過各種方式研究了骨質疏松癥的病理過程。他們表明，在骨重建過程中骨形成缺陷是骨質疏松癥的主要病理機制。在壓力原理下，骨骼不斷更新，破骨細胞去除舊骨（骨吸收），然后成骨細胞添加新骨（骨形成）。當成骨細胞介導的骨形成不如破骨細胞吸收骨有效時，就會發生骨質流失，骨礦物質密度（BMD）降低，嚴重時會發生骨質疏松癥（Bartelt等，2018）。在細胞水平上，成骨細胞和破骨細胞的相互作用和偶聯構成了骨骼的最小功能單元，一些重要的分子在骨骼重建過程中協調了這兩個細胞之間的活動（Kim和Koh，2019年））。破骨細胞是源自造血干細胞的單核細胞-巨噬細胞前體分支。完全活化的多核破骨細胞與破骨細胞前體細胞不同。分化過程受巨噬細胞集落刺激因子和核因子-κB配體的受體激活劑（RANKL）的調節。許多不同的激素和炎性因子通過RANKL途徑調節破骨細胞的生理功能。成骨細胞不同于骨髓間充質干細胞。前體細胞分化為成熟成骨細胞的速率和效率以及成骨細胞的壽命決定了骨形成的速率（Chen等，2018）。在分子水平上，經典Wnt /βcatenin途徑的激活是成骨細胞分化的重要開關。骨硬化蛋白和Dickkopf1相關蛋白1（Dkk1）通過結合并破壞Wnt受體LRP-5來抑制該合成代謝途徑。成骨細胞釋放硬化分子和Dkk1等信號分子，使成骨細胞保持靜止。周期性的機械負荷可以通過骨細胞下調這些抑制因子的表達水平，從而激活成骨細胞的發育以形成新的骨。一項小鼠尺骨負荷研究表明，在尺骨的較高應變區域中，骨硬化蛋白的產生顯著減少，并且在這些位點7天后，這些部位的局部成骨作用也得到了增強Robling等2008這些監管機制非常重要，并且是新藥開發的主要目標。例如，針對硬化蛋白和Dkk1的抗體可在臨床上用于治療溶骨性病變和骨質疏松癥。

因此，成骨分化和骨重塑是治療骨質疏松癥的關鍵，但由于各種原因，成骨細胞的體內研究仍面臨重大挑戰。維持原代骨細胞的原始生理功能很困難。即使在借助生物支架進行3D培養，生物反應器中的動態灌注以及施加機械載荷的情況下，成骨細胞在體外培養過程中也難以形成穩定的3D網絡結構。例如，Boukhechba等2009年使用雙相磷酸鈣（BCP）顆粒培養人類原代成骨細胞。與二維培養相比，向成骨細胞樣表型的分化顯著，成骨細胞特異性標志物被下調，而成骨細胞標志物被上調。但是，在40-80μm的BCP顆粒間隙中會生成隨機細胞聚集體，并且不會生成有序的3D細胞網絡。為了模擬體外的骨骼重塑環境，Mulcahy等人2011年使用Matrigel中的仿生細胞自我仿生過程成功地將骨細胞樣小鼠細胞系（MLO-Y4）培養成3D網格結構，但該結構中的細胞間距約為100μm，無法控制為模擬小鼠骨骼的大小為20–30μm。細胞大小對于骨骼細胞生長和機械傳導過程中的信號傳遞非常重要。同樣，隨著凝膠培養時間的增加，骨細胞在28天后自由增殖并最終破壞了原始的有序細胞網絡結構。

微流體3D組織模型可以更好地模擬生理和臨床相關的微環境。Lee等2012年集成了帶有微圖案和微流體裝置的載玻片，該載玻片上有八個由聚二甲基硅氧烷制成的培養室，并在微流體培養室中成功地培養了3D“初級骨組織”。需要進一步的研究以確定成骨細胞是否可能已經分化為骨細胞，并且組織結構的強度不足以應付機械負荷。如圖1A所示，Gu等2015年探索了一種新的仿生方法來復制3D骨骼網絡結構。他們在PDMS微流腔室中組裝了大小為20–25 μm的雙相磷酸鈣微珠和鼠早期骨細胞（MLO-A5），以模擬3D淚管結構的生理微環境。可以通過長期微流灌注來培養骨細胞，最后獲得了致密且機械穩定的3D網絡組織結構。該方法可用于觀察成骨細胞的礦物質沉積，并已廣泛用于體外研究骨細胞的機械轉導。喬治等2018建立了一個生理芯片實驗室（LOC），以整合三種主要類型的骨細胞（成骨細胞，成骨細胞和破骨細胞）并消除時空限制。該平臺有助于機械負載和骨骼重塑。為了更好地觀察細胞，Sheyn等2019準備了PDMS微流體骨芯片，將其與光學成像方法相結合以實時監測細胞存活，增殖和成骨分化。證明在恒定和連續的介質流動條件下，細胞的成骨分化更高。該芯片設計可以提供一個平臺，用于體外測試細胞對環境的反應以及細胞的光學成像。

圖1.微流體骨組織模型的例子。（A）通過微珠引導的重建在微流室內培養3D骨網絡結構。（B）一種微流控芯片，可同時測量細胞侵襲和外滲。（C） 3D礦化的膠原蛋白骨組織芯片，用于乳腺癌細胞和成骨細胞的共培養。

此外，已經開發了許多基于成骨細胞的用于藥物篩選的3D微型系統。例如，Nason等2011年設計了一種微流控設備，用于細胞藥理學的體外測試，以此作為區分濃度范圍的工具，該濃度范圍保證了該藥物對雷奈酸鍶的抗骨質疏松癥治療的有效性。

通過微流控技術探討骨轉移的機制

許多癌癥，包括前列腺癌，乳腺癌，多發性骨髓瘤和肺癌，在晚期階段都有很高的骨轉移可能性，導致存活率顯著下降（Hao等，2018）。這些轉移可引起一系列與骨骼有關的疾病，例如脊髓壓迫，病理性骨折，高鈣血癥和骨痛。盡管采取了多種治療策略，但轉移性骨病的預后很差（Wu等，2017）。因此，有必要構建仿生骨微環境的骨轉移模型，以更好地了解惡性骨轉移，并開發出新的有效的骨轉移治療方法。在過去的幾十年中，涉及三維細胞培養的研究已大大縮小了體外細胞培養模型與體內動物模型之間的差距（Chaicharoenaudomrung等，2019）。1989年，斯蒂芬·佩吉特（Stephen Paget）提出了“種子和土壤”假說，將癌細胞的轉移與植物種子的傳播進行了比較。為了促進轉移灶的形成，“土壤”（即元環境）必須能夠滋養“種子”（即癌細胞擴散）（Paget，1989年））。當發生骨轉移時，癌細胞會滲出并經歷持續的液體微環境。因此，在對轉移性微環境進行建模時，需要考慮癌細胞所經歷的流體壓力。因此，具有高通量和輕量特性的微流體系統引起了許多研究者的關注。該系統使用很少的試劑即可達到很高的分析精度和靈敏度，并且可以在體外構建類似于人體的3D流動環境。

低流體條件的流體壓力平衡，這有助于內皮和功能性微通道管腔融合，并為惡性腫瘤提供營養支持。與在2D生物學平臺上培養的細胞相比，在微流體生物學系統中培養的癌細胞形成球形細胞聚集體，這些聚集體的上皮標志物（例如CD326）的表達水平下調，而間質標志物（例如，波形蛋白，N-鈣黏著蛋白和纖連蛋白）增加（Kuo等人，2012）。在癌癥骨轉移過程中，骨質疏松癌細胞經歷內皮運動（浸潤和滲出）和定向遷移。穿過內皮的滲透速度與基質細胞和癌細胞之間的主動相互作用有關，癌細胞的靶向遷移取決于歸巢位點的化學吸引力。迄今為止，許多研究人員已經使用微流體系統建立誘導因子的濃度梯度，模擬跨內皮遷移過程中內皮網絡對癌細胞施加的剪切應力刺激，并且更實際地模擬循環系統中癌細胞的狀態。在微流控芯片的幫助下建立的流體動力學模型可以評估形態，遺傳物質，和與腫瘤細胞遷移相關的蛋白質水平。模擬更接近的微環境在體內條件下，Huang等2009年制造了一個平行的微流體通道，該通道由規則間隔的柱的線性陣列分隔開，這些通道可以在3D ECM環境中基于自分泌或旁分泌信號分子對細胞之間的實時相互作用進行成像。維克曼等2008年開發了一種微流體平臺，用于在生物衍生或合成水凝膠中進行三維細胞培養，可以實時監測細胞動態。通過調節刺激因子，例如表皮生長因子（EGF），CXCL12和間質血流，Polacheck等2011年成功地將癌細胞穿過單層內皮細胞遷移到微流控設備中的膠原凝膠中，這表明癌細胞滲出過程得到了很好的模擬。此外，如圖1B所示，Shin等人2011年設計了帶有兩個主要培養室的微流控芯片。腔室I是用于細胞遷移和侵襲測定的血管內腔，腔室E是用于定量檢測的滲出腔。該平臺可以同時模擬癌癥轉移中的浸潤和外滲過程。該結果表明，在血管腔中，癌細胞可以在強應力下從基質凝膠分離，然后粘附在血管外腔中的粘附分子上。

微流體裝置可以模擬骨骼環境，并有助于癌癥的動態骨轉移過程。Hsiao等2009年將包含內皮細胞，成骨細胞和前列腺癌細胞的三培養細胞球接種到微流控生物芯片中。該微流控芯片可以實時監測球體內細胞的生長，并可以抑制前列腺癌細胞的增殖而不會損害其他細胞的生存能力。Jeon等2015在體外開發了PDMS微流體3D通過軟光刻技術建立模型，將內皮細胞和骨間充質干細胞（BMSC）共培養，建立血管化的骨樣微環境，可用于研究乳腺癌細胞的外滲。巧合的是，Bersini等2014年設計了一種用于內皮細胞和BMSCs的血管化微流控設備，包括三個培養基通道和四個獨立的凝膠通道，并引入了乳腺癌MDA-MB-231細胞以形成外滲癌細胞的微轉移模型。如圖1C所示，Hao等2018設計了一種微流體骨芯片，該芯片由頂部培養基儲庫和底部細胞生長室組成，該室由透析膜隔開。骨屑可以自發生長為厚度為85μm的成熟3D礦化膠原蛋白骨組織，其中包含大量礦化的膠原蛋白纖維。膠原纖維在720小時內自然形成，無需分化劑。它們還使癌細胞與骨基質相互作用的機會最大化，并且可以經常觀察到。由于小型化，簡單的操作和超低的單位成本，這種自發的3D模型將指導體外癌癥骨轉移的研究。

結論與未來展望

微流體技術可以通過結合功能化細胞，細胞外基質，細胞生長因子和其他生化刺激物來模擬體內骨骼細胞的動態微環境。該技術有助于評估細胞間的相互作用，從而闡明與骨相關的疾病（如骨質疏松癥和骨轉移癌）的發病機理，并可以導致開發新的治療策略。

但是，這項技術在骨科領域得到廣泛應用之前還有很長的路要走。一方面，人體的內部環境復雜細膩，目前的模型無法模擬整個系統。特別是在骨轉移過程中，癌細胞經歷了連續且密切相關的多步過程，包括許多不可分割的細胞事件（Qiao and Tang，2018年）。）。另一方面，許多微流體疾病模型現在使用永生化細胞系代替患者來源的活細胞。使用個性化細胞代替細胞系可以幫助開發定制療法，從而更有效地指導患者治療。在過去的十年中，在再生醫學中已經廣泛研究了誘導多能干細胞（iPSC）。它們被認為是工程骨組織的有效細胞來源，并且在體外研究中具有強大的骨再生潛力（Rana等，2019）。觀察和評估iPSC與微流體技術的相互作用是未來研究的新思路，它在研究與骨相關的疾病（如骨質疏松癥和骨轉移）的發病機理方面具有巨大的潛力，并有助于開發新的治療策略。總的來說，使用微流控芯片技術產生仿生骨骼微環境取得了令人鼓舞的進展，研究人員需要繼續努力，以更好地了解骨骼疾病的機制，治愈與骨有關的疾病并改善人類的生活質量。

來源：Yang X, Tang Q, Lai C, Wu K and Shi X (2021) Applications and Prospects of Microfluidic Chips in Orthopaedic Diseases. Front. Mater. 7:610558. doi: 10.3389/fmats.2020.610558

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